细胞摄取 NAD+ 的多种途径——由 SIRT1 调节
在这项研究中，研究人员调查了细胞内 NAD+ (iNAD) 水平如何在暴露于细胞外 NAD+ (eNAD) 的几种不同类型的健康细胞中受到调节。
他们发现 iNAD+ 水平在持续暴露 8 小时后达到最高水平，之后这些途径都被下调。
令人惊讶的是，iNAD+ 水平在 24 小时内恢复到基线水平，尽管 eNAD+ 水平仍然很高。
实际上，当提供充足的 eNAD+ 时，细胞会使用所有途径来吸收更多的 NAD+。一旦 iNAD+ 足够，进口更多 NAD+ 的途径就会被关闭。
他们发现 eNAD+ 通过 3 种首选途径使细胞中 iNAD+ 的数量增加了一倍以上*。
- 完整的 NAD+ 直接穿过细胞膜导入
- NAD+ 转化为 NMN，然后由NMN 转运蛋白 Slc12a8 导入
- 进一步将 NMN 转换为 NR，然后由 NRK1 导入
在血液中，NAD+ 分解为 NMN、NR 和 NAM。
一旦进入细胞，这个过程就会被逆转，通过回收循环产生 NAD+。
*NAM 很容易穿过细胞膜并代谢为 NMN，但需要 NAMPT，这是 NAD+ 补救途径中的限速步骤，也是 NAD+ 或更高水平的前体比 NAM 更可取的原因之一。
SIRT1 是维持 iNAD+ 水平的关键调节剂
研究人员发现这一过程的关键调节因子是 SIRT1。
SIRT1 检测细胞内的 NAD+ 水平。随着 iNAD+ 水平的升高，细胞内的 SIRT1 活性也会升高。增加的 SIRT1 活性向细胞发出信号，下调用于输入 NAD+ 的酶的产生。CD73、Slc12a8 和 NRK1 水平降低。
抑制 SIRT1 活性的干预导致CD73 和 Slc12a8 增加 4 倍，因为细胞认为它正在挨饿 NAD+，并伸出手从细胞外获取更多的 NAD+ 和 NMN，表明该途径对调节 iNAD+ 的重要性。
Slc12a8 用于 NMN 运输，不需要时下调
先前的研究表明 Slc12a8 酶在 NAD+ ( r ) 低的不良细胞中被上调。
这项研究发现：
关闭 SIRT1 导致Slc12a8 增加 4 倍，因为信号被破坏并且细胞认为 NAD+ 水平不足。
沉默 SIRT1 足以促使静息细胞中 CD73 和 Slc12a8 转录物增加 4 倍。
Slc12a8 确实进口了大量的 NMN
值得注意的是，当在细胞外添加烟酰胺标记的 [14C] NAD+ 时，沉默 NMN 转运蛋白 Slc12a8 会减少放射性的吸收，这表明该转运蛋白对 NAD+ 的吸收有贡献。
当细胞具有高 iNAD+ 水平时，Slc12a8 被下调。
eNAD+ 暴露降低了外核苷酸酶 CD73、烟酰胺腺嘌呤单核苷酸 (NMN) 转运蛋白 Slc12a8 和烟酰胺核苷激酶 NRK1 的表达。
我们发现 NMN 转运蛋白 Slc12a8 的转录水平在 12 小时 eNAD+ 暴露后已经在细胞中降低，并且与洗涤后恢复的 CD73 相似（图 3C）。
值得注意的是，我们报告 Slc12a8 沉默减少了 [14C]-烟酰胺标记的 NAD+ 摄取，证实了这种转运蛋白在 NAD+ 摄取中的作用及其对将 NAD+ 含量恢复到控制水平的贡献。
Slc12a8 在暴露于 NMN 24 小时后被下调
我们发现在 NRK1、CD73、ENT1 和 Slc12a8 中，只有后者的表达减少了 24 小时 NMN。
NAD+ 完整地穿过细胞膜
这项研究与其他研究一致，表明 NAD+ 可以通过一种尚未发现的转运蛋白完整地穿过细胞膜。
几项研究提供了 NAD+ 穿过未切割哺乳动物细胞质膜的证据。
左图显示了对照组和给予 AMPCP 的 NAD+ 增加，这阻止了 NAD+ 被代谢为前体。
我们的数据还表明，eNAD+ 可以穿过未切割的质膜。事实上，在细胞外浓度的 AMPCP 导致几乎完全的 CD73 抑制的情况下（见图 2H），eNAD+ 仍然可以促使 iNAD+ 显着增加。
iNAD+ 增加不依赖于 NAM 和 NR
有趣的是，这些细胞并不完全依赖 NAM 和 NR 的输入来增加 iNAD+。
NR 由 NRK1 输入细胞，NAM 依赖于 NAMPT。
左图显示当 NRK1 和 NAMPT 被沉默但未消除时 iNAD+ 的增加较低。
这再次表明 iNAD+ 增加的其他途径也有效。
我们发现 NAMPT 或 NRK1 沉默并不能阻止 eNAD+ 暴露后 iNAD+ 增加（图 S2 D 和 E），这支持了至少部分 NAD+ 完整运输的假设。
暴露于标记的 NAD+ 的细胞中不依赖 CD73 的放射性摄取可能归因于完整的 NAD+ 运输。
不同的细胞类型
这项研究的大部分集中在人类肝细胞上，然而，他们在几种不同的细胞类型中发现了相同的效果。
我们还评估了 eNAD+ 随时间对 SHSY-5Y（神经母细胞瘤）、HT29（结直肠腺癌）和 RPTEC（肾近端小管上皮）细胞的影响，并发现在 NAD+ 暴露时 iNAD+ 含量的相似动力学。（图1A）
我们研究了长期暴露于细胞外 NAD+ (eNAD+) 的不同细胞类型中 iNAD+ 水平的动力学。令人惊讶的是，我们发现在初始增加后，iNAD+ 含量下降回控制水平（iNAD+ 重置）。
当 iNAD+ 水平高时，所有 NAD+ 输入途径都被下调
根据作者的说法：
令人惊讶的是，我们发现在初始增加后，iNAD+ 含量下降回控制水平（iNAD+ 重置）。
事实上，eNAD+ 暴露降低了外核苷酸酶 CD73、烟酰胺腺嘌呤单核苷酸 (NMN) 转运蛋白 Slc12a8 和烟酰胺核苷激酶 NRK1 的表达。
几项研究提供了 NAD+ 穿过未切割哺乳动物细胞质膜的证据。
eNAD+对健康有益
这项研究的作者指出，大量对小鼠的研究表明，补充 NAD+ 对细胞健康有益。
我们之前曾报道，在 HeLa 细胞短暂暴露于 eNAD+ 后，iNAD+ 含量会增加，并且这种增加对由星形孢菌素、C2-神经酰胺或 N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍 (MNNG) 引发的细胞凋亡具有显着的细胞保护作用 [32 ]。这些发现与许多报告一致，也显示了 eNAD+ 的细胞保护特性
尽管尚未确定推定的质膜 NAD+ 转运蛋白，但几种膜载体和酶已参与 NAD+ 裂解产物的摄取 [42, 43, 44]。具体来说，eNAD+ 被 CD73 [38,39] 和 CD203a（也称为 PC-1）[58] 裂解为 NMN 和 AMP，或被 CD38 及其旁系同源物 CD157 [40] 转化为二磷酸腺苷核糖 (ADPR) 和 NAM ,59,60]。
无论支持 NAD+ 摄取的机制如何，各种研究都报告说，在体外和体内，eNAD+ 的可用性增加会促进代谢和信号反应，从而总体上改善生物能量学和对压力的抵抗力。
结论
这项研究发现，eNAD+ 可通过多种途径有效导入，并由防止 NAD+ 过度积累的强大系统调节。
本研究中展示的 SIRT1 对 iNAD+ 水平的调节应该让那些担心补充 NAD+ 及其直接前体的潜在负面副作用的人感到欣慰，因为这里研究的细胞具有限制过量 NAD+ 和前体输入的有效方法。
虽然 NR 途径很重要，但它是 NAD+ 和 NMN 都可以利用的途径。NR 不利用其他 2 种途径，因为它在细胞外迅速代谢为 NAM。
大量研究清楚地表明，NR 在血液中不稳定。虽然它可用作最后一步的额外途径，但与 NMN 和 NAD+ 相比，它不是补充的最佳选择，后者在血流中更加稳定，并且有多种途径可以增加细胞内 NAD+。
由于 NAD+ 是迄今为止血液中这些代谢物中最稳定的，并且能够利用这些途径来增加细胞内 NAD+，因此本研究为使用 NAD+ 补充剂（相对于 NMN 或 NR）作为恢复体内 NAD+ 的手段提供了重要支持的细胞。
